高壓細胞破碎儀廠家指導如何提取高質量的RNA

   高壓細胞破碎儀廠家指導提取高質量的RNA的步驟如下：

1、細胞裂解

   細胞的獲取方式不同，采用的裂解方法也不盡相同。

   若是組織中提取，按照每50-100mg樣品加入1ml Trizol的比例加入Trizol，而后勻漿破碎樣品。細胞破碎后在室溫下靜置5分鐘，這樣可以分離出核蛋白復合物（nucleoprotein complexes），然后離心去除細胞碎片。

   若是培養瓶中貼壁細胞，則先用冰PBS洗2次，而后按每10平方厘米區域加入1ml Trizol的比例加入Trizol, 吹打混勻處理。

   若是懸浮細胞，離心收集細胞，去除培養基，然后加入適量Trizol吹打混勻處理。

   可以發現這步操作主要用到了Trizol這個試劑。Trizol的主要成分是苯酚，是有效的蛋白變性劑。它能夠抑制酶活性包括RNAaes，這樣可以保證RNA不會被降解掉，同時Trizol能夠使細胞裂解。

2、抽提RNA

   向EP管中的細胞液加入200ul氯仿，渦旋15秒后，室溫靜置3分鐘，然后4℃，12000rpm,15min條件下離心。離心后分3層，上層為無色或淡粉色含有RNA，中層為白色含有DNA，下層為紅色含有蛋白質和脂質。我們所需的RNA由于氯仿的作用就分在上層的水相中。

   氯仿是有機溶劑，添加氯仿會使細胞內的蛋白變性沉淀，可以通過離心進行去除。同時加入氯仿后，水相和有機相會分層，將水相中的酚抽提以免損傷核酸，另外還能溶解一些脂溶性雜質純化RNA。

3、沉淀RNA

   吸取上層水相于新的EP管中，不要吸取中間層或下層的部分，加入等體積的異丙醇，一般是500ul上清和500ul異丙醇，少的時候可以取200ul的上清。兩者充分混勻，室溫放置10分鐘,然后4℃，12000rpm離心10分鐘。離心結束后，棄去上清，管底可見白色膠狀沉淀，這就是RNA了。

4、洗滌RNA

   為了進行RNA的洗滌，需要用DEPC水配制75%的乙醇溶液，現配現用。DEPC水就是是用DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理過并經高溫高壓滅菌的MiliQ純水，里面不含雜質RNA，DNA和蛋白質。

   按照添加的Trizon的量1:1體積配乙醇溶液，一般是750ul分析純乙醇加上250ul DEPC水，在渦旋儀上使乙醇溶液與RNA充分混勻，4℃，9000rpm,5min離心。然后小心棄去上清，不要吸走管底的RNA哦。

5、再次洗滌RNA

   重復第四步驟，再次洗滌RNA，棄去上清后，控干EP管。室溫下將EP管倒置在吸水紙上5-10min,酌情加入20-50ul DEPC水溶解RNA，這就是我們終提取到的RNA了。

6、測定RNA純度&濃度

   用微量紫外分光光度計取1-2ul RNA檢測即可。A260/A280值在1.8-2.0間符合純度。RNA在260nm處有大吸收，A260=1.0代表RNA的濃度為40ug/ml。A280用于檢測蛋白污染，純RNA樣品的A260/A280=2.1，一般所得比值在1.8-2.0間也是普遍認可的。另外，我們也可以測定A230。A230用于檢測其他污染，主要來自RNA提取試劑，理想的A230值要大于1.5。另外RNA的完整性可以用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證。